20140428 食品微生物之檢驗方法－大腸桿菌群之檢驗

中華民國101年11月19日 署授食字第1011902820號

主　　旨：訂定「食品微生物之檢驗方法－大腸桿菌群之檢驗」，並自即日生效。 依　　據：食品衛生管理法第二十五條。 署　　長　邱文達 　　　　　本案依分層負責規定授權局長決行 　 食品微生物之檢驗方法－大腸桿菌群之檢驗 101年11月19日署授食字第1011902820號公告 1. 適用範圍：本方法適用於食品中大腸桿菌群之檢驗。 2. 檢驗方法：檢體經系列稀釋後，以三階三支進行培養，配合MPN計數之方法。 2.1. 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過 15 C FU／培養皿。 2.2. 器具及材料 2.2.1.  乾熱滅菌器。 2.2.2.  高壓滅菌釜。 2.2.3.  冰箱：能維持5 ± 3℃ 者。 2.2.4.  培養箱：能維持內部溫度溫差 ± 1.0℃ 以內者。 2.2.5.  水浴：能維持水溫溫差 ± 0.2℃ 以內者。 2.2.6.  攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）：能適用於無菌操作者。 2.2.7.  天平：可稱量到 2000 g ，靈敏度為 0.1 g ；可稱量到 120 g ，靈敏度為5 mg。 2.2.8.  精密天平：靈敏度為 0.001 g 。 2.2.9.  酸鹼度測定儀（pH meter）。 2.2.10.吸管輔助器（Pipette aid）。 2.2.11.稀釋用容器：無菌袋或有1000 mL、500 mL、 99 m L及 90 m L標記附蓋（栓）之可滅菌廣口瓶。 2.2.12.試管：15 × 150 m m試管或其他適用者。 2.2.13.發酵管（Durham fermentation tube）：內徑7 × 20 m m或其它適當規格，使用時倒置於15 × 150 m m之試管內。 2.2.14.接種針及接種環（直徑約3 mm）：鎳鉻合金，鉑銥或鉻線材質，或可拋棄式者。 2.2.15.吸管（Pipette）：已滅菌。 1 m L吸管應有 0.01 m L之刻度； 5 m L及 10 m L吸管應有 0.1 m L刻度。 2.2.16.試藥：氯化鈉、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、氫氧化鈉、乳糖（lactose）、硫酸月桂酸鈉（sodium lauryl sulfate）、牛膽汁粉末（oxgall powder）、煌綠（brilliant green）及油酸聚醇山梨酯（polysorbate 80, Tween 80）均採用試藥級；胰化蛋白（tryptose）及蛋白腖（peptone）採用微生物級。 2.2.17.1N氫氧化鈉溶液之配製：            　　稱取氫氧化鈉 4 g ，加入蒸餾水溶解使成100 mL。 2.2.18.稀釋液之配製 2.2.18.1. 生理食鹽水：取氯化鈉 8.5 g ，溶於蒸餾水1000 mL，分裝於稀釋用容器中，經 121℃ 滅菌15分鐘。 2.2.18.2. 磷酸鹽緩衝液（Butterfield's phosphate-buffered dilution water）：取磷酸二氫鉀34 g，溶於蒸餾水500 mL，以1N氫氧化鈉溶液調整pH值為7.2，再加蒸餾水使成1000 mL，以 121℃ 滅菌15分鐘，貯存於冰箱中，作為原液。使用時，取原液 1.25 m L加入蒸餾水使成1000 mL，分裝於稀釋用容器中，以 121℃ 滅菌15分鐘。 2.2.18.3. 0.1%蛋白腖稀釋液（0.1% peptone diluent）：取蛋白腖 1 g ，溶於蒸餾水使成　1000 mL，分裝於稀釋用容器中，經                             121℃ 滅菌15分鐘，最終pH值為7.0 ± 0.1。 2.2.19.培養基 2.2.19.1. 硫酸月桂胰化蛋白培養液（Lauryl sulfate tryptose broth, LST）                2.2.19.2. 煌綠乳糖膽汁培養液（Brilliant green lactose bile broth, BGLB）                              2.3. 檢液之調製 2.3.1.  固態檢體：將檢體切碎混合均勻後，取 50 g ，加入稀釋液450 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。 2.3.2.  粉狀、粒狀或其他易於粉碎之檢體：使用已滅菌之藥勺或其他用具將檢體粉碎後，混合均勻，取 50 g ，以下步驟同2.3.1 .節之操作。 2.3.3.  液態檢體：將檢體振搖均勻混合，取 50 m L，作為原液，以下步驟同 2.3.1 .節之操作。 2.3.4.  冷凍檢體：須解凍者，如冷凍魚、禽畜肉、蔬果、水餃等，應在冷藏之溫度下解凍（如2～ 5℃ ，18小時內即可解凍完全）；亦可使用較高溫度快速解凍（置於 45℃ 以下之水浴中，可在15分鐘內解凍之檢體適用之）。解凍時應經常搖動檢體，以加速解凍。俟檢體解凍後，再予以切碎並混合均勻。不須解凍者，如食用冰塊、冰棒等冰類製品，應速先行使成適當小塊；再依 2.3.1 .節，製成10倍稀釋檢液。如檢驗工作無法立即進行，應將檢體貯存於 -20℃ 。 2.3.5.  凝態及濃稠液態檢體：如布丁、煉乳、海苔醬等，經攪拌均勻後，取 50 g ，以下步驟同 2.3.1 .節之操作。 2.3.6.  系列稀釋檢液：使用已滅菌之吸管，吸取上述之10倍稀釋檢液 10 m L加至稀釋液　90 mL中，依序作成100倍、1000倍、10000倍等一系列稀釋檢液，其稀釋方法如下圖所示。 2.4. 鑑別試驗 2.4.1.  推定試驗：將稀釋檢液及（或）原液充分振搖、混合均勻後，分別吸取 1 m L接種於己裝有硫酸月桂酸胰化蛋白培養液（LST）試管中，每稀釋檢液各接種3支（稱三階三支），自檢液之調製至此步驟應於15分鐘內完成，於 35℃ 培養24                                  ± 2小時，觀察是否產生氣體；未產生氣體者，繼續培養24小時。若仍無氣體產生，為大腸桿菌群陰性；產生氣體者，為可疑大腸桿菌群陽性。 2.4.2.  確定試驗：由 2.4.1 .節產生氣體之各試管中取一白金耳量培養液，接種於另一支煌綠乳糖膽汁培養液（BGLB）於 35℃培養24 ± 2小時，觀察是否產生氣體；未產生氣體者，繼續培養24小時，若仍無氣體產生即為大腸桿菌群陰性；產生氣體者，判定為大腸桿菌群陽性。 2.4.3.  最確數（Most probable number, MPN）：由 2.4.2 .節煌綠乳糖膽汁培養液（BGLB）確定為大腸桿菌群陽性者推算2.4.1.節各階硫酸月桂酸胰化蛋白培養液（LST）大腸桿菌群陽性之試管數，利用最確數表（如附表），推算大腸桿菌群之最確數（MPN/g或MPN/mL）。             2.5. 檢驗流程圖 　 2.6. 可參考使用經確效認可之市售培養基、生化檢測套組或鑑定系統，惟檢驗結果有爭議時，應以本檢驗方法為準。